[摘 要]目的: 探讨脑得生胶囊对家兔血管成形术后内皮功能和内膜增殖的影响。方法:雄性大耳白兔30只，随机分成4组:对照组(n=6)，拉伤组(n=8)，高脂组(n=8)，脑得生组(n=8)。采用高胆固醇喂养加腹主动脉内皮剥脱制作血管狭窄模型，之后行血管球囊扩张成形术。于术后4周处死动物，取血管成形术部位血管标本，用免疫组化测定增殖细胞核抗原（PCNA）的表达水平。并分别于实验初、实验末兔耳缘静脉采血检测一氧化氮(NO)、内皮素（ET-1）浓度。结果:高脂组内膜增生最明显，内膜面积最大而管腔面积最小; 脑得生组内膜面积较高脂组明显减小，管腔面积明显扩大。高脂组血清总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）和ET-1均明显升高,而血清NO明显下降;脑得生组血浆TC 、LDL-C和ET-1明显降低,而血清NO水平明显升高。免疫组化染色:与高脂组比较，脑得生组PCNA的表达水平显著减少，差异具有显著性（p<0.05）。结论: 脑得生胶囊具有抑制家兔血管成形术后内膜增殖和保护血管内皮功能的作用。
[关键词]：脑得生;血管成形术; 内皮功能;内膜增殖;PCNA
The Inhibitory Effect of Naodesheng Capsule on the Endothelial Function and Intimal Proliferation after Angioplasty in Rabbits.
Fu-Jun,Leng Jiyan
Department of geraeology,The first hospital of Jilin university , Changchun,Jilin province,130201
[Abstract]
OBJECTIVE: To explore the inhibitory effect of Naodesheng Capsule on the endothelial function and intimal proliferation after angioplasty in rabbits. METHODS: Maleness adlut rabbit(n=30) were randomized into four groups, control group(n=6),injured group(n=8), hyperlipidemia group(n=8),Naodesheng Capsule group(n=8).Used high cholesterol diet and underwent denudation injury of abdominal aorta with balloon from femoral approach and a stent was implanted at stenosis segment when stenosis had formed angiographically. Animals in eachgroup survived for 4 weeks, The vessel samples from the site of angiop lasty were examined by immunohistochemical method to determinate the expression level of PCNA. And
吉林省中医药管局资助课题
冷吉燕，女，1964年生，吉林省长春市人，汉族，博士，硕士生导师，副教授，主要从事老年心脑血管病的诊治等方面的研究。E-mail：jiyanleng@yahoo.com.cn.Tel:13074324176
venous blood was drawn from the ear of rabbits before and after experiment respectively to detected the contents of nitric oxide and in serum of endothelin in plasma.RESULTS: The results of optical microscopic examination showed there were significant difeernces in intimal area and luminal area between high-lipid group and naodesheng group.Compared with the control group the levels of serum total cholesterol (TC) and low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) in hyperlipidemia group were increased significantly, and nitric oxide (NO) was decreased significantly;while compared with the hyperlipidemia group the levels of serum total cholesterol (TC) and low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) in Naodesheng Capsule group were increased significantly, and nitric oxide (NO) was decreased significantly. The results of inununohistochemical staining showed the expression of PCNA was markedly decreased compared with the hyperlipidemia group, The difference was significant(p<0.05).CONCLUSION: Naodesheng Capsule can protect the endothelial function and inhibit intimal proliferation after angioplasty in rabbits.
[key word] Naodesheng Capsule;angioplasty ;endothelial function;intimal proliferation;PCNA
从80年代起经皮冠状动脉血管成形术（PTCA）已成为治疗冠心病的重要手段，但PTCA术后30%-50%的再狭窄率使这一技术的应用受到很大限制。因而对于术后再狭窄的防治是当前冠心病防治研究的热点。本研究主要探讨中药脑得生对家兔血管成形术后内皮功能及血管平滑肌细胞增殖的影响。
1 材料与方法
1.1材料 健康日本雄性大耳白兔30只，体重2.0土0.3kg，月龄6-8个月，由吉林大学实验动物部提供。在适应性饲养1周后，随机分成4组：对照组6只，拉伤组、高脂组、脑得生组各8只。脑得生（批准文号：国药准字Z20054595）由白求恩医科大学制药厂提供，主要成分：三七皂甙、红花黄色素、葛根、川芍、山楂。MMP2、TIMP1试剂盒购至南京建成生物研究所。TG、TC、HDL-C、LDL-C水试剂盒购于北京中生生物工程高技术公司，ON和血浆ET-1试剂盒购于南京建成生物工程研究所。主要仪器设备：日立7600-020全自动生化分析仪。
1.2方法 雄性大耳白兔30只，体重(2.0土0.3)kg，月龄6-8个月，吉林大学实验动物部提供。在适应性饲养1周后，随机分成4组：对照组6只，拉伤组、高脂组、脑得生各8只。最初4周对照组和拉伤组只喂普通饲料，高脂组和脑得生喂普通饲料加胆固醇1.5g·kg-1 d-1，第四周末除对照组外各组经一侧股动脉用3.5-4.0mm球囊行腹主动脉内膜剥脱术，术后继续4周;第8周末除对照组外各组在X线下经另一侧股动脉行腹主动脉造影，对血管狭窄超过50%的部位，用带导丝的球囊进行扩张。血管成形术后再继续饲养4周后处死动物。
各组家兔分别于实验前、实验末从耳缘静脉抽血测定：①TG、TC、HDL-C、LDL-C水平测定采用北京中生生物工程高技术公司生产的试剂盒。②血清NO和血浆ET-1采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。
动物气栓处死后，4%多聚甲醛血管内膜原位灌流固定，参照X线照片截取血管成形术部位血管标本，标本经乙醇脱水，透明，石蜡包埋，制成蜡块，切片3µm厚，HE染色。行计算机图像分析，测定管腔面积lumen area,LA)，内弹力极包绕面积（internal elastic area,IEA）,计算出内膜面积（newrointernal area,NIA）=IEA-LA。
石蜡切片，采用标准SABC法，DAB显色，各组血管形态及PCNA阳性细胞。
1.3主要观察指标 各组大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C及NO和血浆ET-1水平，增殖细胞核抗原（PCNA）的表达水平。
1.4统计学分析 采用SPSS11.0软件进行分析,计量资料以 ±S表示。两组间比较用t检验，多组比较用F检验，组间两两比较用q检验。
2 结果
2.1血脂测定结果 TC和LDL-C在高脂喂养后明显升高，较实验初及普通非高脂喂养组差异具有显著性(p<0.05)。脑得生组TC和LDL-C较高脂组明显降低，差异具有显著性(p<0.05)，见表1。
表1各组血脂测定结果
组别 | 周数 | TG(mmol/L) | TC(mmol/L) | LDL-C(mmol/L) | HDL-C(mmol/L) |
对照组 | 0w 12w | 0.65±0.09 0.64±0.07 | 1.25±0.26 1.21±0.34 | 0.51±0.06 0.54±0.07 | 0.78±0.27 0.77±0.30 |
拉伤组 | 0w 12w | 0.66±0.09 0.67±0.05 | 1.20±0.30 1.05±0.27 | 0.54±0.09 0.58±1.01 | 0.71±0.23 0.80±0.36 |
高脂组 | 0w 12w | 0.61±0.08 0.75±0.10 | 1.19±0.22 3.28±0.75* | 0.54±0.09 2.91±0.57* | 0.81±0.18 0.66±0.10 |
脑得生 | 0w 12w | 0.65±0.07 0.68±0.11 | 1.23±0.21 1.78±0.88Δ | 0.53±0.10 1.67±0.63*Δ | 0.81±0.18 0.78±0.14 |
* p<0.05 vs 对照组和拉伤组；拉伤组；Δ p<0.05 vs 高脂组。
2.2 NO和ET-1测定结果 拉伤组血清NO降低，血浆ET-1升高，较实验初及对照组差异具有显著性(p<0.05)。高脂组NO明显降低，而血浆ET-1明显升高，较对照组及拉伤组差异具有显著性(p<0.05)。与高脂组相比较，脑得生组 NO明显升高，ET-1明显降低，差异具有显著性(p<0.05)，见表2。
表2 各组各组血清NO和血浆ET-1的变化
组别 | n | NO(umol/L) 实验初 实验末 | ET-1 (pg/ml) 实验初 实验末 |
对照组 | 6 | 98.41±12.58 | 102.23±10.14 | 76.34±19.25 | 80.89±19.64 |
拉伤组 | 8 | 97.52±13.51 | 75.68±13.24* | 74.80±20.70 | 94.57±20.70*Δ |
高脂组 | 8 | 96.78±10.24 | 50.81±10.45* | 76.80±17.59 | 115.78±21.54* |
脑得生组 | 8 | 96.57±13.55 | 112.41±15.51* | 74.42±18.64 | 90.78±18.94*Δ |
* p<0.05 vs 实验初；Δ p<0.05 vs 高脂组。
2.3 血管形态学变化测定结果 高脂组内膜增生最明显，内膜面积最大而管腔面积最小。脑得生组内膜面积较高脂组明显减小，管腔面积明显扩大，差异具有显著性（P<0.05），见表3.
表3 各组血管形态学测量结果
组别 | n | LA(mm2) | NIA (mm2) |
对照组 | 6 | 1.92±0.54 | — |
拉伤组 | 8 | 1.81±0.34 | 0.51±0.12 |
高脂组 | 8 | 1.59±0.61*Δ | 1.18±0.35*Δ |
脑得生组 | 8 | 1.91±0.58*Δ | 0.79±0.41*Δ |
* p<0.05 vs 对照组和拉伤组；Δ p<0.05 vs 高脂组。
2.4 PCNA免疫组化结果 PCNA阳性细胞为核阳性，主要分布于内膜和内弹力板区域。高脂组阳性细胞明显升高，脑得生组阳性细胞面积明显减少，与高脂组相比，差异具有显著性（p<0.05）。
3 讨论
现代医学研究表明,中药在保护血管内皮细胞、防治和减轻血管内膜增殖效果显著[1]。脑得生是临床常用的治疗心、脑血管疾病的新药,是采用现代制药技术研制的一种高效、新型纯中药胶囊制剂。经药效学实验多种指标综合测定表明,它具有扩张冠状动脉血管、增加冠状动脉血流量、显著降低血脂，降低血粘度的作用，对聚积之血小板有解聚作用和很强的抗血栓形成，防治心肌缺血等功效。脑得生的主要成分：三七皂甙、红花黄色素、葛根、川芍、山楂等，其中三七、川芎、红花、山楂均具有活血化疲、疏通经络、降低血液粘滞度，增加冠状血管血流量的作用。本实验通过球囊损伤加高胆固醇饮食制作家兔动脉粥样硬化模型，在此基础上对其进行血管成形术，成功模拟了人体血管成形术的整个过程[2]。同时使用中药脑得生进行干预治疗，证实复方药物从多环节抑制内膜增殖和血管重构的作用。
ET-1与NO是一对影响血管平滑肌细胞增殖及调节血管收缩与舒张的因子。ET-1可通过增加细胞内Ca2+内流和Ca2+的释放[3]，促进血管平滑肌细胞的收缩与增殖。而NO可通过环磷酸鸟苷或环磷酸腺苷途径降低细胞内Ca2+浓度或阻断Ca2+内流,使血管平滑肌舒张并抑制其增殖[4]。本实验结果显示动脉粥样硬化和血管成形术后内皮的损伤导致了ET-1释放增多、NO合成受阻。脑得生具有降低血脂，抗动脉粥样硬化，明显升高NO、降低ET-1的作用，从而具有保护血管内皮、抑制内膜增殖的作用。
再狭窄不仅是局部血管损伤后的一种修复反应，且是多种细胞因子和生长因子介导的局部血管重建和再塑及血管平滑肌细胞（SMC）迁移、增殖、凋亡及细胞基质分泌和堆积的过程[5]。PCNA是一种仅在增殖细胞中合成与表达的36kd的多肽，其表达和合成与细胞的增殖周期有关，在静止期细胞内含量很低，自G晚期逐渐增加，S期量达到高峰[6]。因此，它可有效地反映细胞的增殖功能。本实验发现脑得生治疗组再狭窄动脉壁PCNA阳性细胞面积比高脂组显著减少，从而提示抑制平滑肌细胞增殖的信号通路可能是脑得生防治血管再狭窄的主要机理之一。
总之，本实验观察到脑得生具有保护血管内皮和抑制血管内膜增生两方面的作用，对血管成形术后再狭窄具有防治作用，可能是一个很有前途的药物，值得进一步深入研究。
4 参考文献
[1] 高笑舸,崔桅.中药对血管内皮细胞保护作用的研究概况[J].天津药学,2003,15(2):42-45.
[2] 郗永安,王丽蕙.血管成形术后再狭窄实验模型[J].中国介入心脏病学杂志，1996,3(4):189-191.
[3] Lauer MR,Gunn MD,Clusin WT.Endothelin activates voltagedependent Ca2+ current by a G protein-dependent mechanism in rabbit cardiac myocytes.J Physiol, 1992,448:729－747.
[4] Inagami T,Naruse M,Richard H.Endothelium as an endocrine organ.Annu Rev Physiol,1995,57:171－189.
[5] Bauters C,Isner JM.The biology of restenosis[J].Prog Cardiovasc Dis,1997,40 (2):107-116
[6] Prelich G, Tan CK, Kostura M, et al. Functional identity of Proliferating cell nuclear antigen and a DNA Pglynerasedelta auxiliaryportein[J].Natuer,1987,326(4):5 17-610.
